Preparation and biocompatibility of EDC-NHS crosslinked chitosan-polyethyleneoxide-silk fibroin electrospun nanofibers
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摘要: 为提高壳聚糖(CS)-丝素蛋白(SF)复合纳米纤维的可纺性，解决其易溶胀从而导致纳米纤维尺寸稳定性较差的问题，采用聚氧化乙烯(PEO)提高纳米纤维的可纺性，用静电纺丝来制备纳米纤维，然后通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)和 N-羟基丁二酰亚胺(NHS)进行交联改性，制备了CS-PEO-SF三元体系的纳米纤维。利用FTIR、XRD、单纤维强力机、SEM分别表征了CS-PEO-SF纳米纤维的分子间相互作用、结晶性能、纳米纤维的力学性能和形貌，同时考察纳米纤维的溶胀度；利用细胞毒性和细胞培养测试表征了CS-PEO-SF纳米纤维的生物相容性。结果表明：PEO的加入可以有效提高CS-SF的可纺性，CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径范围为240~510 nm，各组分纤维形态较好；随着SF含量的增加，CS-PEO-SF纳米纤维结晶性能、拉伸强度和断裂伸长率逐渐增大。经交联后的CS-PEO-SF纳米纤维结晶能力和溶胀度降低，力学性能提高。交联前后CS-PEO-SF纳米纤维均不具毒性，有良好的细胞相容性。Abstract: In order to improve the spinnability of chitosan (CS)-silk fibroin (SF) composite nanofibers and solve the problem of poor dimensional stability of nanofiber membrane caused by its easy swelling, polyethylene oxide (PEO) was used to improve the spinnability of the composite fibers in this study. Electrospinning was used to prepare CS-PEO-SF nanofibers, which were cross-linked and by 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The intermolecular interaction, crystallization properties, mechanical properties and morphology of CS-PEO-SF nanofibers were characterized by FTIR, XRD, single fiber strength machine and SEM. The swelling degree and biocompatibility of CS-PEO-SF nanofibers was also characterized by cytotoxicity and cell culture tests. The results show that the addition of PEO can effectively improve the spinnability of CS-SF. The average diameter of CS-PEO-SF nanofibers is from 240 nm to 510 nm. The fiber morphology of each component is good. With the increase of SF content, the crystalline properties, tensile strength and breaking elongation of CS-PEO-SF nanofibers gradually increase. After crosslinking, the crystallinity and swelling degree of the CS-PEO-SF nanofibers decrease, and the mechanical properties increase. Before and after cross-linking, the CS-PEO-SF nanofibers has no toxicity and has good cell compatibility.
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Keywords:
- chitosan /
- polyethylene oxide /
- silk fibroin /
- nanofibers /
- cross-linking /
- biocompatibility
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人体创伤发生的几率逐年增加[1-2]，目前，临床上常采用的修复外周神经损伤的方法是自体移植，但其受来源及供区不足的限制，因此组织工程材料−神经导管应运而生[3-4]。静电纺丝是将高分子聚合物制备成纳米级纤维的有效方法，具备纳米结构的纤维状支架更接近组织微环境，静电纺丝制备的具有多孔结构的组织工程支架可以模拟天然细胞外基质结构，有利于细胞间信号和营养的传递[5-6]。
壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰基产物，具有生物降解性和生物相容性，在医药领域具有广阔的开发应用前景[7-9]。然而，CS的快速降解特性及力学性能差等问题使其应用范围受到限制。因此，CS作为医用材料通常需要与其他高分子材料复合以改善其性能[10-12]。丝素蛋白(SF)具有优异的生物相容性、体内可降解性、对于细胞有较好的黏附、扩增、分化和生长[13-15]及力学性能优良等优势。聚氧化乙烯(PEO)是一种亲水性和生物相容性的高聚物[16-18]，具有柔性分子链，能够显著提高CS和SF的柔韧性、亲水性和降解性能，是有效增韧剂[19-20]，由于PEO具有良好的水溶性、优异的溶液流变性、与有机溶剂的结合作用等优点。因此，在电纺过程中，加入PEO可以通过氢键反应使分子内与分子间的排斥力变弱，从而提高溶液的可纺性和纤维的柔韧性，提高CS-SF的纺丝性能，采用PEO与CS和SF共混改性，各组分都是环境友好生态材料。既保持了整个体系的生态友好，又能改善材料性能。由于CS和SF中含有大量的亲水基团，较易溶胀，从而导致纳米纤维的尺寸稳定性较差，对应用造成一定影响，因此常用交联的方法对其进行改性。本研究采用PEO来提高CS-SF的可纺性，通过用碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行交联改性，其作为可实现快速多肽缩合反应的水溶性碳二亚胺型缩合剂，其分子呈线性结构，用于接基与伯胺的缩合反应，并已获得广泛用途。制备了一系列纳米纤维，对纳米纤维的表面形貌、结晶性能、力学性能、溶胀度、毒性、生物相容性等进行了表征。
1. 实验材料及方法
1.1 原材料
壳聚糖(CS)，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；丝素蛋白(SF)，纯度为90%，上海源叶生物科技有限公司；聚氧化乙烯(PEO)，相对分子质量Mr=1 000 000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，纯度为98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)，纯度为98.5%，上海麦克林生化科技股份有限公司；吗啉乙磺酸一水合物(MES)，纯度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RSC96雪旺细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司；CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)，合肥新恩源生物技术有限公司；乙醇，70%~75%，盘锦天源药业有限公司；戊二醛，北京索莱宝科技有限公司；叔丁醇，化学纯试剂，国药集团化学试剂有限公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，北京索莱宝科技有限公司。
1.2 纳米纤维的制备
配置质量分数为90wt%的醋酸水溶液，分别称取CS、PEO(与CS质量比为10%)，溶于90wt%的冰醋酸中，制成3wt%的溶液。在溶液加入不同质量分数的SF，室温条件下搅拌12 h，得共混纺丝液记作样品CS-PEO-SF1~CS-PEO-SF6，各溶液中成分的质量比如表1所示，将溶液静置脱泡后用于静电纺丝。
表 1 纺丝液各成分的质量比Table 1. Mass ratios of each components of spinning solutionSmaple CS PEO SF CS-PEO-SF1 10 1 0 CS-PEO-SF2 10 1 1 CS-PEO-SF3 10 1 1.5 CS-PEO-SF4 10 1 2 CS-PEO-SF5 10 1 2.5 CS-PEO-SF6 10 1 3 CS-PEO-SF7 10 1 3 Notes: CS—Chitosan; PEO—Polyethylene oxide; SF—Silk fibroin; CS-PEO-SF6—CS-PEO-SF nanofiber before crosslinking; CS-PEO-SF7—Cross-linked CS-PEO-SF nanofiber. 采用深圳市通力微纳科技有限公司生产的TL-Pro-BM型高压静电纺丝机进行静电纺丝，得到CS-PEO-SF静电纺纳米纤维。纺丝条件为：环境温度为30℃，相对湿度为20%，静电压为20 kV，喷丝口距接收板距离为20 cm，流速为2.0 mL/h，滚轮转速为1 000 r/min。利用日本电子(JEOL)生产的JSM-7800F型SEM观察静电纺丝纳米纤维，并通过软件Nano Measurer对SEM图像随机取点测量纳米纤维的平均直径。将制备的静电纺丝纳米纤维浸泡在EDC与NHS质量比为 2∶1 的乙醇-水溶液中(其中乙醇与水的体积比为9∶1)，以MES为缓冲剂调节pH值至5.0，于4℃下交联反应24 h，取出后用去离子水反复冲洗3次，转入冷冻干燥机干燥24 h，得到不同交联程度的CS-PEO-SF静电纺丝纳米纤维记作样品CS-PEO-SF7。EDC交联反应原理如图1所示。EDC首先与SF的羧基反应，形成氨基反应活性的O—酰基脲中间体。该中间体与氨基反应，通过酰胺键形成这两个化合物的键合物。然而，该中间体在水溶液中很不稳定，并易于水解。通过加入NHS可以将该中间体转化为具有氨基反应活性的NHS酯，从而大大提高了EDC介导的缩合反应效率。MES在反应中起到缓冲剂的作用，调节反应环境的pH值。
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图 1 碳化二亚胺(EDC)交联反应原理Figure 1. Principle of carbodiimide (EDC) cross-linking reactionNHS—N-hydroxysuccinimide1.3 溶胀度测试
将静电纺丝膜浸于蒸馏水中，完全浸泡后，用吸水纸迅速擦干膜表面的液体后称重W1(g)，然后再将膜置于80℃的真空烘箱24 h后，用电子天平称量膜的干重W2(g)，静电纺丝膜的溶胀度Sw计算如下：
SW=W1−W2W2×100% (1) 1.4 力学性能测试
将静电纺丝膜裁剪成规格0.3 cm×4 cm的矩形长条，采用YG004型电子单纤维强力机进行力学性能测试。拉伸速度为 10 mm/min。拉伸强度σ(MPa)和断裂伸长率
ϵ (%)计算如下[21]：σ=FbMδ (2) ϵ=L1L×100% (3) 式中：Fb—拉伸断裂力(N)；M—样品宽度(mm)；δ—样品厚度(mm)；L1—断裂长度(mm)；L —样品的初始长度(mm)。
1.5 纳米纤维的细胞毒性试验
将稀释好的雪旺细胞种植在96 孔细胞培养板中，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养24 h后，吸出旧的细胞培养液，换入新的细胞培养液，再加入含有不同纳米纤维的浸提液，不加浸提液的为空白组，在相同条件下分别培养12~96 h。取出细胞培养板，在各孔中加110 μL CCK8聚培养基混合液，在细胞培养箱中放置30 min后，用酶标仪在450 nm下测定各孔的吸光度，取平均值并通过与对照组比较来判断细胞的毒性。采用浸提液法对生物医用材料进行毒性试验，以细胞的增殖度为标准划分安全等级[22]，如表2所示。
表 2 细胞增殖率与细胞毒性水平的对应关系Table 2. Correspondence between cell proliferation rate and cytotoxicity levelCell proliferation rate/% Cytotoxicity level ≥100 0 75–99 1 50–74 2 25–49 3 1–24 4 0 5 1.6 体外细胞培养
为了观察细胞在材料上的黏附能力及形态，所有材料采用75%乙醇浸泡5 min进行消毒，然后用无菌PBS清洗，每次5 min，重复3次。随后将材料放入细胞培养板，每孔大约接种1×103 mL细胞，放入细胞培养箱培养72 h作为SEM观察的标本。待培养时间到达后，先吸出旧培养基，PBS洗3次，然后用4%戊二醛固定4 h，随后进行乙醇梯度脱水各10 min，50%叔丁醇和叔丁醇各处理10 min，最后用冻干机冷冻干燥，喷金后采用日本电子(JEOL)生产的JSM-7800F型SEM进行观察。
2. 结果与讨论
2.1 CS-PEO-SF纳米纤维交联前后的结构
图2为交联前CS-PEO-SF纳米纤维的FTIR图谱。可以看出，交联前CS-PEO-SF纳米纤维在3 400 cm−1附近的吸收峰归属于O—H伸缩振动和N—H弯曲振动，1 631 cm−1和1 409 cm−1处分别为酰胺基Ⅰ带和酰胺Ⅱ带中C—N伸缩振动和N—H弯曲振动，1 092 cm−1处为酰胺基Ⅲ带中N—H官能团弯曲振动[22]。由EDC-NHS交联机制可知，分子间的酰胺化使对应的伯氨基数减少，酰胺键增加，在交联后的CS-PEO-SF纳米纤维的FTIR图谱中主要表现为酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带收峰强度比值的减小，即1 631 cm−1处、1 409 cm−1处和1 092 cm−1处的吸收峰面积比值减小，这些吸收峰强度的变化表明发生了交联反应[23]。
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图 2 交联前后壳聚糖-聚氧化乙烯-丝素蛋白(CS-PEO-SF)纳米纤维的FTIR图谱Figure 2. FTIR spectra of chitosan-polyethylene oxide-silk fibroin (CS-PEO-SF) nanofiber before and after cross-linking2.2 CS-PEO-SF纳米纤维的结晶性能
图3为 CS和交联前后CS-PEO-SF纳米纤维的XRD图谱。可以看出，CS-PEO-SF纳米纤维在21.84°处具有明显的衍射峰，经过EDC-NHS交联剂交联改性后，CS-PEO-SF纳米纤维在21.84°处的衍射峰变宽，强度降低。通过拟合计算可知，CS-PEO-SF1、CS-PEO-SF3、CS-PEO-SF6、CS-PEO-SF7纳米纤维的结晶度分别为63.24%、68.66%、71.32%、59.37%，因此当SF加入到共混体系中后，结晶度提高；当交联后，体系的结晶度下降。由于聚合物的结晶度与XRD衍射峰的强度呈正比，而衍射峰的位置没有发生变化，因此SF作为一种结晶成核剂，加快了结晶速度，使CS-PEO-SF纳米纤维的结晶程度提高，XRD衍射峰的强度也相应增强。不同SF用量对CS-PEO-SF纳米纤维结晶性能的影响不同，当CS与SF质量比为10∶3时，XRD衍射峰强度最高。对比CS-PEO-SF6和CS-PEO-SF7纳米纤维可以看出，EDC-NHS加入后，CS-PEO-SF纳米纤维的结晶度下降，由于交联作用限制了高聚物分子的活动能力，破坏了分子链的规整性，从而导致高聚物结晶能力的降低。
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图 3 CS和交联前后的CS-PEO-SF纳米纤维的XRD图谱Figure 3. XRD patterns of CS and CS-PEO-SF nanofibers before and after cross-linking2.3 CS-PEO-SF纳米纤维的微观形貌
图4为加入PEO前后CS-SF纳米纤维的SEM图像。可以看出，未加PEO时，CS-SF很难进行静电纺丝，几乎不成丝，加入PEO后很大程度上改善了CS-SF的可纺性，形成比较均一稳定的纳米纤维。图5为加入不同SF含量的CS-PEO-SF纳米纤维的SEM图像。表3为CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径。由图5和表3可见，随着SF含量的增加，SF的分子链发生伸展，CS-PEO-SF粒径越大，使CS-PEO-SF纳米纤维直径变大，对比图4和图5可知，PEO的加入很大程度上改善了CS-SF纳米纤维的可纺性，CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径范围为240~510 nm。各组分纤维形态较好，纤维直径分布比较均匀集中，没有明显的珠粒。
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图 4 加入PEO前后CS-SF纳米纤维的SEM图像Figure 4. SEM images of CS-SF nanofibers before and after PEO addition2.4 CS-PEO-SF纳米纤维的力学性能
图6为CS-PEO-SF纳米纤维的力学性能。可见，随着SF含量的增加，CS-PEO-SF纳米纤维的拉伸强度和断裂伸长率逐渐变大，这是由于：(1) SF对CS-PEO-SF纳米纤维的结晶起促进作用，使其晶核密度增大，纳米纤维的结晶度提高，分子链排列更加规整，当纳米纤维受到外力作用时，晶格会沿着拉伸强度方向重新排布，且折叠链伸展，因此CS-PEO-SF纳米纤维的拉伸强度和断裂伸长率提高；(2) 随着SF含量的增加，CS-PEO-SF纳米纤维的直径逐渐增加，直径分布逐渐均匀，也会提高CS-PEO-SF纳米纤维的力学性能。对比CS-PEO-SF6和CS-PEO-SF7纳米纤维可以发现，交联后CS-PEO-SF纳米纤维的断裂拉伸强度达到23.73 MPa，较未交联的CS-PEO-SF纳米纤维断裂拉伸强度(19.16 MPa)提高了1.24倍，而交联后CS-PEO-SF纳米纤维断裂伸长率也有所增大，约为未交联CS-PEO-SF纳米纤维断裂伸长率的1.02倍。这主要是由于通过EDC交联处理后，分子内部及分子之间的结合更加紧密，从而使分子间作用力增强，使交联后CS-PEO-SF纳米纤维较未交联的CS-PEO-SF纳米纤维表现出更加优良的力学性能。通过力学性能分析可知，当CS∶SF质量比为10∶3时，CS-PEO-SF纳米纤维的拉伸强度和断裂伸长率分别为19.16 MPa和115.3%，表现出良好的强度和柔韧性。
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图 5 不同SF含量的CS-PEO-SF纳米纤维的SEM图像Figure 5. SEM images of CS-PEO-SF nanofibers with different SF contents表 3 CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径Table 3. Average diameters of CS-PEO-SF nanofibersMass ratio of CS to SF Average diameter/μm 10∶0 0.24 10∶1.0 0.25 10∶1.5 0.34 10∶2.0 0.42 10∶2.5 0.45 10∶3.0 0.51 ![]()
图 6 不同SF含量CS-PEO-SF纳米纤维力学性能Figure 6. Mechanical properties of CS-PEO-SF nanofibers with different SF contents2.5 交联前后CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度
图7为与不同质量分数EDC交联的CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀率。可见，EDC质量分数越大，CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度越低；未交联的CS-PEO-SF纳米纤维溶胀度可达到1 900%；经EDC-NHS交联后，CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度随EDC质量分数的增大而减小，当EDC质量分数为5wt%时，CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度为392%，经过交联后其平衡溶胀比均小于未交联纳米纤维。这是由于交联前分子间主要是单纯的范德华力和氢键作用力，分子间这些力都是物理作用力，而化学交联处理过的CS-PEO-SF纳米纤维分子间形成了化学键，使分子间作用力大大增强，结构更加致密，减少了结合水的数量，从而降低了纳米纤维的吸水性。当EDC质量分数为6wt%时，CS-PEO-SF纳米纤维交联度已经基本恒定，CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度也达到了稳定状态，因此，CS-PEO-SF纳米纤维的交联度越大，溶胀度越低，通过对EDC质量分数的调控，可得到适宜溶胀度的CS-PEO-SF纳米纤维。
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图 7 不同质量分数EDC交联CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度Figure 7. Swelling degree of cross-linked CS-PEO-SF nanofibers with different mass fractions of EDC2.6 CS-PEO-SF纳米纤维的细胞毒性
图8为CS-PEO-SF纳米纤维的细胞毒性，其中a为空白组，b、c、d、e分别为CS与SF质量比为10∶0、10∶1、10∶2和10∶3时CS-PEO-SF纳米纤维的细胞毒性测试，f为CS与SF质量比为10∶3时CS-PEO-SF纳米纤维交联后的毒性测试。由图8和表2可以看出，加入不同含量的SF后，CS-PEO-SF纳米纤维的浸提液分级均大于100%，为0级，不具有细胞毒性。表明加入SF有促进细胞增长和分化的作用，且交联后的CS-PEO-SF纳米纤维与未交联的CS-PEO-SF纳米纤维相比，没有明显的增长变化，说明EDC-NHS是一种无毒的交联剂，但并不能在一定程度上促进细胞的生长和分化，交联前后CS-PEO-SF纳米纤维均具有良好的细胞相容性和生物安全性，可作为医用材料。
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图 8 CS-PEO-SF纳米纤维的细胞毒性Figure 8. Cytotoxicity of CS-PEO-SF nanofibersa—Blank; b—CS-PEO-SF1; c—CS-PEO-SF2; d—CS-PEO-SF4; e—CS-PEO-SF6; f—CS-PEO-SF72.7 CS-PEO-SF纳米纤维的体外共培养
图9为CS-PEO-SF纳米纤维体外共培养的SEM图像。可见，含有SF的CS-PEO-SF纳米纤维的细胞数量明显增多，细胞伸出为数众多的伪足，且细胞呈扁平形态，紧密地黏附在材料表面。产生这种现象的原因与CS-PEO-SF纳米纤维中SF的含量相关，即SF的含量越高，CS-PEO-SF纳米纤维的生物相容性相对越好，越有利于细胞的生长和黏附，使细胞生长状态良好。交联后的CS-PEO-SF纳米纤维与未交联的CS-PEO-SF纳米纤维相比，细胞数目没有明显的增长变化，进一步说明EDC-NHS是一种无毒的交联剂。
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图 9 CS-PEO-SF纳米纤维体外共培养的SEM图像Figure 9. SEM images of in vitro co-culture of CS-PEO-SF nanofibers3. 结 论
以生物相容性良好的壳聚糖(CS)、丝素蛋白(SF)及聚氧化乙烯(PEO)为原料，通过用碳化二亚胺(EDC)和N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)对CS-PEO-SF纳米纤维进行交联改性，并研究了其表面形貌、结晶性能、力学性能、溶胀度、毒性、生物相容性等。
(1)当SF含量增加时，CS-PEO-SF纳米纤维的直径增大，CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径范围为240~510 nm。
(2) CS-PEO-SF纳米纤维在2θ为21.84°处具有明显的衍射峰，SF含量增加，衍射峰强度增大。
(3)当SF含量增加时，CS-PEO-SF纳米纤维的拉伸强度和断裂伸长率呈单调增大的趋势。当CS与SF的质量比为10∶3时，CS-PEO-SF纳米纤维的拉伸强度和断裂伸长率出现最大值，分别为19.16 MPa和115.3%。
(4)交联后，CS-PEO-SF纳米纤维的结晶性能降低，溶胀度下降，CS-PEO-SF纳米纤维拉伸强度和断裂伸长率较未交联的CS-PEO-SF纳米纤维分别提高了1.24倍和1.02倍。
(5)交联前后CS-PEO-SF纳米纤维均具有良好的细胞相容性和生物安全性，可作为医用材料。
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图 1 碳化二亚胺(EDC)交联反应原理
Figure 1. Principle of carbodiimide (EDC) cross-linking reaction
NHS—N-hydroxysuccinimide
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图 2 交联前后壳聚糖-聚氧化乙烯-丝素蛋白(CS-PEO-SF)纳米纤维的FTIR图谱
Figure 2. FTIR spectra of chitosan-polyethylene oxide-silk fibroin (CS-PEO-SF) nanofiber before and after cross-linking
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图 3 CS和交联前后的CS-PEO-SF纳米纤维的XRD图谱
Figure 3. XRD patterns of CS and CS-PEO-SF nanofibers before and after cross-linking
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图 4 加入PEO前后CS-SF纳米纤维的SEM图像
Figure 4. SEM images of CS-SF nanofibers before and after PEO addition
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图 5 不同SF含量的CS-PEO-SF纳米纤维的SEM图像
Figure 5. SEM images of CS-PEO-SF nanofibers with different SF contents
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图 6 不同SF含量CS-PEO-SF纳米纤维力学性能
Figure 6. Mechanical properties of CS-PEO-SF nanofibers with different SF contents
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图 7 不同质量分数EDC交联CS-PEO-SF纳米纤维的溶胀度
Figure 7. Swelling degree of cross-linked CS-PEO-SF nanofibers with different mass fractions of EDC
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图 8 CS-PEO-SF纳米纤维的细胞毒性
Figure 8. Cytotoxicity of CS-PEO-SF nanofibers
a—Blank; b—CS-PEO-SF1; c—CS-PEO-SF2; d—CS-PEO-SF4; e—CS-PEO-SF6; f—CS-PEO-SF7
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图 9 CS-PEO-SF纳米纤维体外共培养的SEM图像
Figure 9. SEM images of in vitro co-culture of CS-PEO-SF nanofibers
表 1 纺丝液各成分的质量比
Table 1 Mass ratios of each components of spinning solution
Smaple CS PEO SF CS-PEO-SF1 10 1 0 CS-PEO-SF2 10 1 1 CS-PEO-SF3 10 1 1.5 CS-PEO-SF4 10 1 2 CS-PEO-SF5 10 1 2.5 CS-PEO-SF6 10 1 3 CS-PEO-SF7 10 1 3 Notes: CS—Chitosan; PEO—Polyethylene oxide; SF—Silk fibroin; CS-PEO-SF6—CS-PEO-SF nanofiber before crosslinking; CS-PEO-SF7—Cross-linked CS-PEO-SF nanofiber. 
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表 2 细胞增殖率与细胞毒性水平的对应关系
Table 2 Correspondence between cell proliferation rate and cytotoxicity level
Cell proliferation rate/% Cytotoxicity level ≥100 0 75–99 1 50–74 2 25–49 3 1–24 4 0 5
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表 3 CS-PEO-SF纳米纤维的平均直径
Table 3 Average diameters of CS-PEO-SF nanofibers
Mass ratio of CS to SF Average diameter/μm 10∶0 0.24 10∶1.0 0.25 10∶1.5 0.34 10∶2.0 0.42 10∶2.5 0.45 10∶3.0 0.51
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