海藻酸钠是存在于褐藻类中的天然多糖，具有来源丰富、价格低廉、生物相容性好和凝胶过程温和等特点^{[1, 2]}。随着3D打印技术的兴起，海藻酸钠作为药物与细胞的载体材料，以直写的方式直接成型一定的几何形状，在组织工程、制药及临床医学等领域具有很好的应用前景^[3]。

生物支架在体外培养和体内移植的过程中，材料降解进程要与细胞外基质的分泌相协调，其降解速度要与组织生长速度相匹配，是决定组织再生成败的关键因素之一^[4-6]。因此，研究生物材料降解速度的调控方法具有重要意义。

在组织工程应用中，海藻酸盐凝胶所处环境因素(温度、酸碱度等)基本不发生改变，降解的主要原因是螯合的二价离子会与凝胶周围环境中的其他离子发生交换反应，导致凝胶在生理环境中较容易降解，失去凝胶特性^[7-8]。特别是，如果将交联的二价离子洗脱，海藻酸盐凝胶就会快速分解。目前，海藻酸盐凝胶降解速率的调控策略主要是疏水改性^[9-11]和改变凝胶网络聚集程度^[12-17]。由于不必引入酸性或毒性物质，更有利于细胞的加载，使得后者更受组织工程领域的青睐。当分子间的作用力加强，空间结构更致密，结构越不容易被破坏，越不容易降解。BOUHADIR等^[12]通过增加钙离子浓度或二次水浴交联来增加交联度，这种方法虽然可以减缓其在体内的降解速度，但仍存在突释，可调控性差，不易与组织再生匹配。MUN等^[13-15]使用异丙醇(IPA)作为交联剂的溶剂替代去离子水(DW)，试验结果表明海藻酸盐分子链在IPA所创造的极性界面条件会产生聚集，并在流体剪切作用下形成高度有序结构，红外光谱检测也证明分子链构象更紧密。ZHANG等^[16]在上述方法的基础上增加了乙醇(EA)界面对照组。研究发现，EA界面组同样表现出有序的胶体结构，而IPA所制备纤维的有序性和致密度要强于EA组；纤维微观结构的差别与IPA、EA、DW的极性高低高度相关，也直接影响了纤维在溶胀度、降解曲线、力学性能等方面的表现。可见，界面极性可改变海藻酸盐凝胶网络的聚集程度，具有调控降解速率的潜力。

然而，现有研究多是对比两不同极性溶剂条件下海藻酸盐凝胶网络聚集特征及性能表现，缺少单一溶剂极性梯度的影响规律研究。鉴于此，在海藻酸钙凝胶生物支架的制备工艺中，通过交联剂中IPA与DW比例的变化，获得一系列极性梯度的交联界面，深入考察极性梯度对海藻酸钙凝胶单元聚集形态的影响和降解性能可调控性。

1.   交联进程与凝胶单元聚集形态

海藻酸钙凝胶支架制备过程如图1(a)所示。海藻酸钠水溶液与交联剂溶液分别从同轴喷头的壳、芯区域挤出，芯层氯化钙溶液的钙离子在径向方向上，由内向外发生扩散，不断与壳层的海藻酸钠交联定型，进而形成稳定的中空纤维结构^[18-22]；继而，中空纤维沉积在接收板上，并按照三轴运动平台预先规划的路径逐层搭接成一定形状的支架；成型的支架置于水浴中进行二次交联，保障纤维间的粘结强度和交联完全。其中，较关键的是挤出过程中发生的第一次交联，如图1(b)所示。不仅是由于该阶段奠定了中空纤维的构型，更是该阶段界面处的物理化学条件(溶剂极性)对中空纤维内壁形貌特征、降解曲线等有重要作用。

图  1  中空纤维同轴交联直写原理图: (a)海藻酸钙支架制备；(b)交联原理过程图；(c)不同界面极性条件下海藻酸链聚集情况

Figure  1.  Hollow fiber coaxial crosslinking directly written schematic diagram: (a) Preparation of Sodium alginate scaffolds; (b) Cross-linking schematic process; (c) Aggregation of sodium alginate molecular chains under various polarity conditions

IPA—Iso-propyl alcohol; DW—Deionized water

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取两相流界面处微元进行分析，如图1(c)所示：海藻酸钠分子链在微元中呈无规线团构象，在IPA基交联剂中形成的界面处，由于IPA的脱水作用，使得该微元体积变小，海藻酸钠分子链暴露且致密地聚集在微元表面；而在DW基交联剂形成界面处，水分子和钙离子均有向海藻酸钠溶胶扩散、融合的趋势。同时，分子链受芯部IPA和钙离子的吸引而向心运动，周向连接团聚的可能性高于其他方向，从而形成有序的凝胶单元。受界面处IPA与钙离子浓度差异以及沿径向方向的作用力梯度差异，分子链团聚的机会也不同，形成的凝胶单元尺寸、疏密状态也有差异。外壁面附近的分子链由于无聚敛运动，仍然是无序团状。

2.   材料与方法

2.1   试验试剂与仪器

实验主要材料和试剂包括海藻酸纳(化学纯CP、纯度99%、分子量198.11、国药)，氯化钙(分析纯AR、分子量 110.8、国药)，IPA (分析纯 AR、分子量 60.1、国药)。

为了研究溶剂极性对降解的作用，设置六组IPA与DW的混合比例：纯DW、20% (w/v)、40% (w/v)、60% (w/v)、80% (w/v)、纯IPA，分别记作DW、IPA_20%、IPA_40%、IPA_60%、IPA_80%、IPA；将氯化钙分别溶解于上述溶剂中，浓度统一为3%(w/v)。同轴挤出与二次水浴所用交联剂采用同一极性溶剂。

利用液体介电常数分析仪(100M-43GHz，北京)进行各混合比例溶剂的介电常数检测。利用扫描电子显微镜(SEM，EV3020，EASSON，德国)观察中空纤维表面微观结构。其它仪器包括：电子天平(EWS，AB104-N，北京)；磁力加热搅拌器(H01-1B，上海梅颖浦)；台式离心机(L500，湖南湘仪)；电热鼓风干燥箱(GZX-9070MBE，上海博迅)；真空冷冻干燥箱(LGJ-10D，北京四环)等。

2.2   混合溶剂极性评定

现有的溶剂极性评定方法有溶剂显色法、平衡动力学测量、光谱测量以及多参数测量等方法^{[23, 24]}。在众多的纯溶剂极性评定方法中，溶剂显色法是最方便和直接的，但受限于溶剂种类的数量以及溶质分子对溶剂组分的亲和性，混合溶剂的极性评定是比较复杂的^[23]。对此依据MASAAKI等^[23]所提出的二元溶剂体系极性评定公式，对IPA与DW各混合比例溶剂极性大小进行插值计算：

其中：

$P\left({X}_{{\rm{O}}}^{{\rm{o}}}\right)$−混合溶剂中有机溶剂的摩尔分数为${X}_{{\rm{O}}}^{{\rm{o}}}$时的极性指数；O、W、OW−分别表示为不掺水溶剂、纯水、混合溶剂；$P\left({{i}}\right)$−溶剂极性指数p，其中i＝O、W、OW、表示某种溶剂的“经验”极性；X−有机溶剂的摩尔分数/水的摩尔分数；δ、K−平衡常数。

依据文献[25]，IPA极性指数$P\left({\rm{O}}\right)$取值为3.9；去离子水极性指数$P\left({\rm{W}}\right)$取值为9.0；IPA和DW按比例1∶1混合后的溶液极性$P\left({\rm{O}}{\rm{W}}\right)$取值为6.9；平衡常数δ和K取值分别为3.5和15.47。

2.3   支架降解率

为了模拟体内体液浸润环境，设计了一套体外循环降解系统，如图2所示。其中，磁力搅拌器创造体液紊流环境并维持37℃环境温度。在降解过程中需定期更换PBS磷酸盐缓冲液(Biosharp BL551A 10x)，为了防止PBS被污染，降解过程在超净工作台进行，每两天更换一次缓冲液。

图  2  体外循环降解系统

Figure  2.  Extracorporeal circulation degradation system

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以质量损失率W_L定量评价降解程度。(1) 将生物支架裁剪为统一尺寸，置于生物反应器中，在紊流环境下进行降解测试；(2) 在固定的时间点取出支架，经30%、60%、90%、95%、100%梯度浓度的酒精脱水；(3) 将脱水后的支架，放置于干燥箱中，温度设置为60℃，干燥6 h；(4) 使用精密电子天平称量质量，每个试件测量五次，取其平均值。

质量损失率表达式为

其中：${W}_{\rm{L}}\left(\%\right)$−质量损失率；${W}_{{\rm{i}}}$−支架初始质量；${W}_{\rm{d}}$−支架在某一降解时间监测点的质量。

3.   结果与讨论

3.1   溶剂的极性梯度

根据文献[23]中二元混合溶剂极性评定方法，对各IPA与DW混合比例所制备溶剂的极性指数进行经验性估算。极性大小与实测介电常数如表1和图3所示。

表  1  IPA与DW混合比例所制备的溶剂极性指数p与介电常数ε (25℃)

Table  1.  Solvent polarity index p and dielectric constant ε with different mixing ratio of IPA and DW (25℃)

	DW	IPA20%	IPA40%	IPA60%	IPA80%	IPA
p	9.00	7.80	7.29	6.89	6.37	3.90
ε	78.4	76.6	56.7	37.8	22.4	18.3
Notes: DW—Deionized water; IPA—Iso-propyl alcohol; IPAx%—x concentration of IPA.

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图  3  IPA浓度对溶剂极性的影响

Figure  3.  Influence of concentrating IPA on solvent polarity

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一般而言，溶剂分子的极性大小与其介电常数有关，介电常数越大，极性越强；反之介电常数越小，则极性越小^[26]。由表1及图3可知，随着交联剂中IPA比例的增加，溶剂极性指数由9逐渐降至3.9，与华^[26]的研究结果一致。另外，溶剂极性指数并非线性降低，而是呈现反三角函数曲线特征。

3.2   极性界面对纤维微观形貌的影响

用扫描电镜可以直观地观察无水状态下的海藻酸钙纤维的微观结构，如图4所示。

图  4  海藻酸钙纤维微观形貌SEM图像

Figure  4.  Microstructure of calcium alginate fiber by SEM images

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可以看出，内壁表面无论是何种极性界面的结果，均出现由胶束团聚形成的线状凝胶单元，且沿圆周方向规则排布；同时，随着界面极性的降低，该凝胶单元变细变短，间隙变小，更加致密。这可能是由于同轴环境，使得钙离子与极性界面对海藻酸盐分子链的吸引作用呈径向辐射，且由内向外梯度减弱；在该作用下，海藻酸盐分子链沿径向运动聚集成线状胶束，同一半径位置的可能优先团聚并沿周向延伸，形成更大的棒状凝胶单元，从而具有显著的方向性。该特征在断面图最为显著；当界面极性较低时，同一半径环上的分子链聚集点更多，较早地拉开分子链的间距，周向延伸的趋势被中断，团聚的凝胶单元趋向短小致密；同时，极性界面的影响程度也沿径向由内向外逐渐减弱，远离极性界面的胶束仍呈无序状态，不利于胶束团聚和定向延伸生长。如内壁表面所示，无论是何种极性界面，均出现由胶束团聚形成的线状凝胶单元，且沿圆周方向规则排布；同时，随着界面极性的降低，该凝胶单元变细变短，间隙变小，更加致密。其中DW样品凝胶单元直径约3.03 μm，平均长度82 μm，IPA样品胶束直径约0.689 μm，平均长度42 μm；外壁表面图中，由于远离极性界面，未出现显著胶束团聚现象。随着界面极性的降低，逐渐出现胶束团聚体并趋于致密有序。

致密化趋势则是低极性溶剂的作用结果。众所周知，在低极性或非极性溶剂中，多糖分子链内或链间非共价作用力，包括氢键、偶极相互作用、疏水相互作用和静电相互作用等，会使分子链趋向聚集，甚至发生无序-有序的转变^{[17, 27-28]}。在该机制作用下，凝胶分子链聚集所形成的凝胶单元趋向短小致密。海藻酸钠虽难溶于IPA，无法直接通过溶剂环境对其分子链构象产生影响，但是通过与其同轴流动的交联剂提供极性界面条件，也可以对其分子链构象产生影响；特别是对于所制备的中空纤维，壁厚仅65.5~177.5 μm左右，先后两次交联分别形成的内外极性界面，影响贯穿整个薄壁层。

3.3   极性界面对支架降解的影响

图5为DW和IPA支架样品的降解外观特征。可以看出，支架样品首先经历溶胀阶段，相较于高极性的DW样品，IPA样品无明显的体积增大；第三天时，支架样品均处于溶胀平衡状态；第五天时，DW支架样品的中空纤维单元已经完全坍塌，微通道消失殆尽，胶体融合。此时IPA支架样品外层开始坍塌，内部形状仍保持完好。直观看出IPA起到了减缓海藻酸钙凝胶降解速度的作用。

图  5  降解过程中海藻酸钙凝胶支架形貌变化

Figure  5.  Changes in calcium alginate hydrogel bio-scaffold morphology during degradation

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由渗透导致的溶胀行为和离子运动，使得纤维从PBS溶液中开始吸收更多的水分和钠离子、钾离子，并从海藻酸盐中置换出钙离子，造成蛋壳状结构解体并容纳更多水分进入分子链，而凝胶结构开始变形，也导致纤维的降解。各极性基纤维的溶胀度表现与微观形貌的致密度特征一致，即极性越低，纤维越致密有序，溶胀度越低，降解越慢。

鉴于相关研究(Dena等^[29]，何淑兰等^[30])表明海藻酸盐凝胶在降解5天后力学性能大幅衰减而无法保持自身形态，研究仅对各组样品进行为期5天的质量损失率定量检测，结果如图6所示。

图  6  溶剂极性对海藻酸钙凝胶支架降解的影响

Figure  6.  Effect of solvent polarity on calcium alginate hydrogel bio-scaffold scaffold degradation

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可以看出，各组支架的质量损失曲线均呈现三段式发展，在前2天缓慢增加，在第3天开始降解速度有明显加快，第5天开始又再次趋缓，其中IPA_40%样品整个降解更加线性。从质量损失曲线可以看出IPA浓度的增大导致降解速度减慢。DW样品的降解时间最快，第5天DW纤维支架的失重率为91.16%，降解率最高；IPA样品在5天内降解程度最低，质量损失了70.05%。而IPA_20%、IPA_40%、IPA_60%、IPA_80%的质量损失率依次为88.61%、80.77%、74.06%、73.86%。

值得注意的是，降解初期，DW样品降解程度最小，而IPA样品的降解程度最大，与支架最终的降解结果恰恰相反。这可能是由于海藻酸钙为亲水性凝胶，在达到溶胀平衡状态前，网络链间的大孔或空洞会被自由水逐渐填充，在网络链被充分溶胀后，凝胶方以一定的速度开始降解。也就是说，溶胀平衡过程迟滞了降解进程。低极性溶剂所制备的样品致密度高，容纳水分子的空间变小，溶胀度减少，更早开始降解；但随着时间的推移，分子链高聚集特征使钙离子不易置换的能力逐渐占据上风，在第2~3天左右逐渐逆转；最终，相同时间内，界面极性越弱，其制备的凝胶网络越致密，支架降解越慢。

海藻酸盐中空纤维作为血管的临时替代物，需服务于血管生成，其降解速度要与内皮细胞生长速度相匹配。SAHOTA等^[31]将人脐静脉内皮细胞接种在支架上，5天后在支架上可观察到毛细血管样管道，1周后微血管形成，两周就与体内的血管相连通。SHANDALOV^[32]将内皮细胞、纤维母细胞以及成肌细胞培养于支架材料上，移植在小鼠股动、静脉处1周后支架中形成了肌瓣状血管。可以看出，界面极性对材料本身降解周期的调控基本满足血管生成的需要，但能否与细胞非线性的生长速率^[13]进行全过程精准匹配，还有待载细胞体外实验和体内实验验证。

4.   结 论

研究了极性界面对海藻酸钙纤维的凝胶单元形貌与降解性能的影响。所研究结果有利于生物支架降解周期的精确控制，有利于组织再生速度的匹配，促进海藻酸钠在组织工程和生物制药领域的应用。

(1) 极性界面附近所形成的凝胶单元形态更加短小致密；低极性溶剂的脱水作用使纤维壁厚变薄，凝胶单元有序性范围扩展到外壁面。

(2) 有序而密实的凝胶单元形态可以减缓海藻酸钙纤维的降解速率；降解曲线具有分段特征，极性梯度在4天后对降解呈现规律的调控能力。

(3) 溶胀平衡过程具有一定的降解迟滞作用；低极性界面所制备的样品致密度高，溶胀度较低，虽降解速度较慢但更早地开始降解。