Dual pH responsive azoxystrobin controlled release microspheres constructed from porous calcium carbonate and its biosecurity
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摘要:
刺激响应性农药控释系统为提高农药利用效率和减少环境污染提供了强有力的策略。本文在采用共沉淀法制备多孔碳酸钙微球(CaCO3)的基础上，通过浸渍吸附法获得负载嘧菌酯(Az)的多孔碳酸钙微球(Az/CaCO3)，并在复合微球表面进一步包覆单宁酸(TA)-Cu2+络合物，构建了一个具有双pH响应性的嘧菌酯控释系统(Az/CaCO3@TA-Cu)。理化性能研究表明成功制备了Az/CaCO3@TA-Cu微球，其载药量为16.42%。模拟释放研究结果表明，Az/CaCO3@TA-Cu具有良好的pH控释性能，在pH=7的磷酸缓冲溶液中96 h累积释放率为36.99%，而在pH=5和pH=9条件下的累积释放率分别为74.32%和58.79%。菌丝体生长速率实验表明，Az/CaCO3@TA-Cu对禾谷镰刀菌生长具有较好的抑制作用，中值抑制浓度为纯Az和Az/CaCO3的6.58倍和3.28倍。此外，小麦发芽率和斑马鱼存活率统计结果显示，Az/CaCO3@TA-Cu相对于Az/CaCO3和纯Az表现出更优的生物安全性。
Abstract:Stimuli-responsive pesticide controlled release systems provide a powerful strategy for improving pesticide utilization efficiency and reducing environmental pollution. In this study, based on the preparation of porous calcium carbonate microspheres (CaCO3) by co-precipitation method, porous calcium carbonate microspheres loaded with pyrimethanil (Az) (Az/CaCO3) were obtained by impregnation and adsorption method, and the surface of the composite microspheres was further encapsulated with a tannic acid (TA)-Cu2+ complex, which constructed a pyrimethanil controlled-release system with dual pH-responsiveness (Az/CaCO3@TA-Cu). Physicochemical performance studies showed successful preparation of Az/CaCO3@TA-Cu microspheres with 16.42% drug loading. The results of simulated release studies showed that Az/CaCO3@TA-Cu had good pH-controlled release properties, with a cumulative release rate of 36.99% in phosphate buffer solution at pH=7 for 96 h, whereas the cumulative release rates at pH=5 and pH=9 were 74.32% and 58.79%, respectively. Mycelial growth rate experiments showed that Az/CaCO3@TA-Cu had a better inhibitory effect on the growth of Fusarium graminearum, with median inhibitory concentrations of 6.58 and 3.28 times that of pure Az and Az/CaCO3. In addition, wheat germination and zebrafish survival statistics showed that Az/CaCO3@TA-Cu exhibited superior biosafety relative to Az/CaCO3 and pure Az.
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Keywords:
- azoxystrobin /
- calcium carbonate /
- tannic acid /
- drug delivery system /
- controlled release
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农药在现代农业生产中扮演着至关重要的角色[1-3]。然而，传统农药制剂在使用过程中存在靶标利用率低、环境污染严重等问题，这不仅导致巨额经济损失，还对人类健康造成了严重危害[4-6]。近年来，农药控释系统因其能够极大提高农药利用率并减少对环境的副作用而成为农药领域的研究热点[7-10]。在其中，以多孔材料为载体构建的农药控释系统备受关注。据报道，包括中空二氧化硅[11]、金属有机框架(MOF)[12]、黏土[13]和蒙脱石[14]在内的多种材料均可实现农药的控释，并在不同程度上提高农药的利用效率[15]。然而，由于这些载体材料的生产成本高、制备工艺复杂等问题限制了这类农药控释剂的应用发展。因此，有必要研究制备一种生产成本低且易于加工的载体材料，以满足农药控释剂在实际应用中的需求。
近期，多孔碳酸钙因其自然界中含量丰富、制备方法简单、生物相容性好等优点，被认为是一种极具应用前景的农药载体材料[16-19]。然而，多孔碳酸钙直接用作药物吸附载体时存在一个问题，即由于其表面裸露大量的孔隙，容易导致药物在使用过程中突然释放，从而降低了农药的利用率[5, 11, 20]。为了解决这个问题，许多研究者发现，在多孔碳酸钙外部包裹一层响应性壳层材料，不仅可以避免农药的突然释放，还可以增加载药系统的响应功能，从而获得具有多响应性控释特性的系统[7, 14, 20-25]。例如，Zhou等[18]使用果胶包覆负载咪鲜胺的碳酸钙微球，成功地防止了咪鲜胺在碳酸钙中的突然释放，同时使药物载体系统具有对pH和果胶酶的双重刺激响应性能，进而提高了咪鲜胺的利用率。另外，Xiang等[23]在负载扑草净的碳酸钙颗粒表面络合单宁酸和Fe3+络合物，不仅避免了扑草净直接与水接触，而且使其具有pH响应释放性能。因此，通过对农药载体材料进行包覆以获得复合结构材料，可以有效提高载药系统的多响应性，并进一步提高农药的利用率。
本文首先通过共沉淀法制备了多孔CaCO3，并利用浸渍法将嘧菌酯(Az)负载到多孔CaCO3微球上，形成了Az/CaCO3。接着，在Az/CaCO3外部包裹了单宁酸(TA)/Cu2+络合物，构建了一种具有双pH响应性释放功能的嘧菌酯农药载药系统(Az/CaCO3@TA-Cu)。采用扫描电子显微镜(SEM)、能谱仪(EDS)、傅里叶变换红外(FTIR)、热重分析仪(TGA)、马尔文Zeta电位仪等对Az/CaCO3@TA-Cu的形貌和结构进行了详细分析。接下来，研究了嘧菌酯在土壤中的释放行为，并考察了不同pH值下的响应性释放性能。此外，通过菌丝体生长速率实验和斑马鱼安全试验评估了Az/CaCO3@TA-Cu的抑菌性能和生物安全性能。
1. 实验材料与方法
1.1 原材料
嘧菌酯(98%)由江苏艾津作物科技集团有限公司提供。醋酸钙(CA)、碳酸铵(AC)和分子量为(C6H10O5)n的分析纯可溶性淀粉(SS)购自国药集团化学试剂有限公司。N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷购自上海麦克莱恩生化科技有限公司。氯化铜二水合物(CuCl2·2H2O)和单宁酸(TA)购自中国阿拉丁有限公司。磷酸氢二钠十二水合物(Na2HPO4·12H2O，99%)和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O，99%)购自上海化学试剂有限公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和Hoagland营养液购自青岛高科技园区海博生物科技有限公司。
1.2 Az/CaCO3@TA-Cu微球的制备
将1.0 g可溶性淀粉加入到100 mL去离子水中，在搅拌下加热至80℃并保持30 min。冷却至室温后，向溶液中加入醋酸钙(浓度为0.1 mol/L，100 mL)，并搅拌30 min。随后，加入碳酸铵(浓度为0.1 mol/L，100 mL)，继续搅拌反应12 h。反应结束后，通过离心(10 000 r/min，5 min)分离固体反应产物，用去离子水洗涤3次。最后，进行冷冻干燥，得到样品CaCO3。
将一定量的CaCO3超声分散于含嘧菌酯的N, N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)中，然后，在25℃下以300 r/min的速度搅拌悬浮液，并将其过夜。之后，使用10 000 r/min的速度离心10 min，收集Az/CaCO3，接着进行冷冻干燥，最终得到Az/CaCO3粉末样品。
将获得的Az/CaCO3粉末加入去离子水中，并进行超声处理 30 min。接下来，加入 1 mL 单宁酸(TA) 溶液 (24 mmol/L)， 搅拌 10 min后加入 1 mL 铜离子(Cu2+)溶液 (24 mmol/L)。随后，通过加入NaOH溶液(0.1 mol/L)调节溶液的pH至8。最后，将所得悬浮液以10 000 r/min的速度离心分离，然后用水洗涤分离固体3次以除去多余的TA和Cu2+，最后进行冷冻干燥以获得Az/CaCO3@TA-Cu样品。
1.3 制备样品的表征
使用扫描电子显微镜(蔡司，EVO LS-15，SEM)观察制备样品的形貌及元素分布。使用Zeta 电位及粒度仪(阿拉丁，Zetasizer Nano Z)测定微球的表面电荷和粒径分布。使用傅里叶变换红外光谱仪(江苏天瑞，FT-IR6600，FTIR)确定样品中的功能基团和化学键信息。使用热重分析仪(德国耐驰，STA2500)来分析材料的热稳定性和成分分解情况，加热速率为10℃/min，氮气流量为2 mL/min，测试温度为25℃至800℃。
1.4 载药率的测定
首先需要绘制嘧菌酯(Az)在甲醇溶液中的标准曲线。具体步骤如下：取5 mg 的Az原药，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为50 mg/L的Az母液。再将上述母液进行稀释，配制成浓度为2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L、10 mg/L、12.5 mg/L的一系列标准溶液。使用紫外分光光度计(上海元析，UV-5800)，在波长为207 nm处测量各个标准溶液的吸光度，绘制Az在甲醇溶液中的标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，通过拟合得到标准曲线的线性方程。
通过以下方法测定Az/CaCO3@TA-Cu及Az/CaCO3中Az的含量。首先称取5 mg样品加入到10 mL甲醇中，超声处理30 min。随后，通过离心收集上清液，将其定容于50 mL容量瓶中，静置后，取4 mL上清液用0.22 μm有机过滤膜过滤后，通过紫外分光光度计测试吸光度，测定提取过程重复3次。根据标准曲线计算Az的浓度。通过下式计算载药率(LC)：
LC=0.001C1V1W1×100% (1) 其中：C1表示定容后Az的浓度(mg/L)；V1表示溶液定容后的溶液体积(50 mL)；W1表示添加的样品质量(5 mg)。
1.5 土壤柱中的释放研究
土壤样品取自地表15 cm深处，首先经过研磨处理，然后再通过600 μm筛筛选。接着，将土壤在121℃条件下高温灭菌20 min。然后，将土壤分别与Az原药、Az/CaCO3、Az/CaCO3@TA-Cu混合，采用可调式混匀仪(北京大龙，MX-S)振荡混匀以确保土壤中Az的浓度为10 mg/kg。为构建土壤柱，准备长度为300 mm的层析柱，填充顺序从下至上分别为脱脂棉、石英砂(425 μm~187.5 μm)、药物和土壤的混合物、石英砂(425 μm~187.5 μm)。随后，以25 mL/h的速率缓慢地向土壤柱中加入去离子水，并收集渗滤液。最后，用紫外分光光度仪在207 nm处测定Az的释放量。
1.6 控释性能研究
对于Az/CaCO3@TA-Cu的控制释放行为，本文采用透析法研究不同pH条件下的释放过程。首先将5 mg 的Az/CaCO3@TA-Cu加入透析袋中，然后加入1 mL 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH分别为5、7和9)，然后将封好的透析袋浸于100 mL相应pH的PBS溶液中并置于摇床中振荡。固定间隔时间，取4 mL的释放液，并补加等量的新介质。最后，使用紫外分光光度计测试溶液中的Az的吸光度，并通过以下公式计算Az的累计释放率：
Cumulativerelease=(Ct+vV∑t−10Ct)VM0×100% (2) 其中：M0表示最初负载在Az/CaCO3@TA-Cu中的Az的量；V表示释放体系中溶液总体积(V=100 mL)；v表示在一定时间内提取的释放介质的量(v=4 mL)；Ct表示从t−1到t时间内释放介质中Az的浓度(mg/mL)。
1.7 抑菌活性研究
采用菌丝生长速率研究不同样品的抗禾谷镰刀菌活性。首先将Az原药、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu与PDA培养基混合，制备不同浓度(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.6 mg/L)的含农药培养基，每个处理重复5次，并添加空白对照。随后将20 mL含农药的培养基倒入消毒过的培养皿中(直径90 mm)，待其冷却凝固后，将培养的禾谷镰刀菌菌饼(直径5 mm)接种到培养基的中心。随后将PDA培养基置于生化培养箱(河南迎工，SPX-100B)中，在28℃下培养5天。分别在第三、第四、第五天在不同的垂直方向上测量3次径向菌丝生长的平均直径。最后，使用以下公式计算菌丝生长抑制率(MGI)：
MGI=Dc−DtDc−Dm×100% (3) 其中：Dc表示对照组菌丝的直径；Dt表示处理组菌丝的直径；Dm表示接种菌饼直径(5 mm)。通过SPSS软件进行分析，计算独立回归方程、相关系数和有效抑菌中浓度。
1.8 小麦发芽率测定
为评估不同样品对小麦种子发芽率的影响，本文进行了如下实验：首先配制了含有不同浓度农药的Hoagland营养液(10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L)，同时准备了不含药物的Hoagland营养液作为空白对照。接着，选择颗粒均匀的小麦种子，用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 min进行消毒，然后用去离子水洗涤。随后，在黑暗条件下将小麦种子在相应浓度的含农药的Hoagland营养液中浸泡12 h。
挑选浸泡后形态均匀的50颗小麦种子，将它们放置在垫有滤纸的培养皿中。然后，向培养皿中添加20 mL相应浓度的含药Hoagland营养液以提供养分。接着，将带有种子的培养皿放置在培养箱中，在黑暗条件下萌发3天。随后，在自然光和黑暗交替的条件下培养，7天后记录发芽情况。
1.9 制备样品对斑马鱼的毒性研究
为了评估不同样品对水生物种的影响，本实验采用斑马鱼作为模拟生物[12, 22]。将斑马鱼置于自来水中，在培养箱中培养。然后，分别取 15 条斑马鱼 (长度为 (2.5±0.5) cm)置于含有不同浓度样品的悬浮液中 (浓度分别为0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L )。以纯水中的斑马鱼作为对照，统计斑马鱼在 48 h 时的死亡数量，所有浓度均重复 3 次。
2. 结果与讨论
2.1 CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的形貌及元素分析
图1(a)为CaCO3的SEM图像，从图中可以看出CaCO3为规则的球形形貌，粒径约为3.30 μm，其表面具有大量的孔隙结构。图1(b)为Az/CaCO3@TA-Cu的SEM图像，可以看出其表面非常粗糙，其原因是由单宁酸和Cu2+的络合物沉积在碳酸钙表面而形成的，粒径增大至10.62 μm左右。Az/CaCO3@TA-Cu的SEM-EDS元素图谱显示，O、Ca、Cl和Cu元素均匀分布在Az/CaCO3@TA-Cu球体表面，进一步验证了单宁酸-Cu2+络合物对Az/CaCO3的包裹。
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图 1 CaCO3 (a)和单宁酸包覆的嘧菌酯/多孔CaCO3载药系统(Az/CaCO3@TA-Cu) (b)的SEM图像及Az/CaCO3@TA-Cu中的O、Ca、Cl和Cu元素映射图(c)Figure 1. SEM images of CaCO3 (a) and tannic acid-coated pyrimethanil/porous CaCO3 carrier system (Az/CaCO3@TA-Cu) (b), elemental mapping of O, Ca, Cl and Cu in Az/CaCO3@TA-Cu (c)2.2 制备样品的电位分析
图2(a)给出了不同样品的电位统计图。其中， Az 和CaCO3的电势(ζ)分别为−30.5 mV和−11.0 mV，将Az负载在CaCO3中后，Az/CaCO3的ζ为−24.5 mV。单宁和Cu2+的络合物进一步包裹后，Az/CaCO3@TA-Cu微粒的ζ升至−14.3 mV，表明单宁酸和Cu2+的络合物成功沉积在载药碳酸钙表面。
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图 2 Az、CaCO3、Az/CaCO3、Az/CaCO3@TA-Cu的电位图(a)和红外吸收光谱图(b)Figure 2. Potentials (a) and FTIR spectras (b) of Az, CaCO3, Az/CaCO3, and Az/CaCO3@TA-Cu2.3 制备样品的红外分析
图2(b)为不同样品的红外吸收光谱图。其中， Az在
2235 cm-1和1594 cm-1出现的吸收峰为其化学结构中—CN基团和C=C基团的拉伸振动。CaCO3在877 cm-1和745 cm-1出现的吸收峰归属于CO32-的平面外弯曲振动和平面内弯曲振动。在Az/CaCO3的红外吸收光谱图中Az和CaCO3的特征吸收峰均明显存在，证实了Az成功负载在CaCO3微粒中。单宁酸在1300 ~1600 cm-1之间的微小吸收峰为苯酚基团的伸缩振动，这也证实单宁酸对Az/CaCO3进行了包裹。2.4 制备样品的热重分析
图3(a)给出了不同样品的热重分析图。Az在180~330℃之间出现的明显失重主要归因于Az的热分解。Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在180~330℃之间的失重率分别为44.92wt%和16.48wt%，可以得出Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu中Az的质量含量分别为44.92wt%和16.48wt%。Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在650~760℃的失重主要为样品中CaCO3颗粒的热分解。
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图 3 Az、Az/CaCO3、Az/CaCO3@TA-Cu的TG曲线(a)和在土壤中的释放曲线(b)Figure 3. TG curves (a) and release curves in soil (b) of Az, Az/CaCO3, and Az/CaCO3@TA-Cu2.5 土壤柱中的释放性能分析
为接近于农药实际应用过程，本文通过土壤柱淋溶实验研究了不同样品在土壤中的释放过程。如图3(b)所示，通过淋溶相同体积的水后，土壤柱中Az原药和Az/CaCO3的Az损失率均高于Az/CaCO3@TA-Cu。当淋溶水体积为425 mL时，Az原药和Az/CaCO3的药物损失率分别为90.61%和62.18%，而Az/CaCO3@TA-Cu的药物损失率为58.11%。因此，相较于原药Az和Az/CaCO3，Az/CaCO3@TA-Cu表现出明显的药物缓释性能，可有效提高农药的利用效率。
2.6 控释性能分析
通过模拟释放实验研究比较了Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的药物释放性能。如图4(a)所示，从Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在甲醇水溶液(V甲醇∶V水体积比为 3∶7)中的释放行为可以看出，在36 h之前Az/CaCO3的累计释放率高于Az/CaCO3@TA-Cu，这可能是由于CaCO3中的Az的突释。而在36 h后两种样品释放率稳定增加最终都趋于平衡，累计释放率分别为92.54%和80.71%，这表明Az/CaCO3外层包裹单宁后，实现了药物的缓释，提高了药物的利用率。此外，还研究了Az/CaCO3@TA-Cu在不同pH值PBS缓冲液中的释放过程。由图4(b)可见，在pH值为7时，Az/CaCO3@TA-Cu中Az的96 h累计释放率为36.99%，而在pH值为5和9时，累计释放率则分别达到74.32%和58.79%。由此可见，Az/CaCO3@TA-Cu具有酸碱双pH响应性释放性能，这种性能主要归因于载药系统中载体材料的性质。在碱性条件下，Az/CaCO3@TA-Cu中的TA-Cu覆盖层结构发生解离，利于内部吸附的Az释放到介质中。在酸性条件下，Az/CaCO3@TA-Cu中的CaCO3会发生结构坍塌，促进药物的快速释放。
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图 4 (a) Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu中Az的释放曲线；(b)不同pH条件下 Az/CaCO3@TA-Cu的释放曲线Figure 4. (a) Release curves of Az in Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu; (b) Release curves of Az/CaCO3@TA-Cu under different pH conditions图5为4种不同的动力学方法(零阶、一阶、Higuchi和Ritger–Peppas模型)拟合Az/CaCO3@TA-Cu的释放曲线图。表1列出了不同pH值下动力学研究的具体结果。根据拟合方程的相关系数判定，当pH为5和7时Az/CaCO3@TA-Cu的释放过程更符合Ritger-Peppas动力学方程。当pH为9时，一阶方程模型更加适用于此时的Az/CaCO3@TA-Cu释放曲线。同时，在进行Ritger-Peppas动力学方程拟合时，发现不同pH值条件下的释放指数(n)均低于0.45，证明了Az/CaCO3@TA-Cu中的药物释放过程主要为Fick扩散。
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图 5 使用零级方程(a)、一级方程(b)、Higuchi方程(c)、Ritger-Peppas方程(d)拟合Az/CaCO3@TA-Cu在不同pH条件下的曲线Figure 5. Fitting of Az/CaCO3@TA-Cu curves at different pH conditions using zero-order equation (a), first-order equation (b), Higuchi equation (c), and Ritger-Peppas equation (d)表 1 通过拟合几个动力学方程计算Az/CaCO3@TA-Cu释放Az的参数Table 1. Parameters for Az/CaCO3@TA-Cu release of Az by fitting several kinetic equationsModel pH k n R2 Zero-order 5 0.555 − 0.618 7 0.448 − 0.572 9 0.294 − 0.740 First-order 5 0.159 − 0.895 7 0.130 − 0.813 9 0.155 − 0.963 Higuchi 5 6.570 − 0.851 7 3.237 − 0.921 9 5.397 − 0.820 Ritger-Peppas 5 28.416 0.226 0.978 7 11.815 0.259 0.991 9 21.980 0.235 0.951 Notes: k—Release rate constant; n—Release characteristic index; R2—Regression coefficient. 2.7 抑菌活性分析
通过菌丝生长速率测定不同样品对禾谷镰刀菌的抑制效果。图6分别给出了禾谷镰刀菌在添加不同药剂种类和不同药物含量的培养基中培养不同时间的照片。由图可见，随着培养基中药物浓度的增加，抑制活性越来越明显。在相同药物浓度(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.6 mg/L)下，Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu相对于原药Az表现出更长效的抑菌性能。表2给出了上述样品抑菌性能的进一步分析结果，在培养3天时，原药Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的中值效应浓度(EC50)分别为18.19 mg/L 、5.77 mg/L和1.88 mg/L。在培养4天时，原药Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的EC50分别为11.41 mg/L 、7.87 mg/L和2.79 mg/L。在培养5天时，原药Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的EC50分别为18.40 mg/L、5.61 mg/L和2.80 mg/L。统计结果表明， Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu的EC50明显低于原药Az，主要是制备的样品使药物的分散性提高的同时也增加了药物的长效性。另外，Az/CaCO3@TA-Cu的抗真菌活性高于Az/CaCO3的原因可能为Az/CaCO3@TA-Cu可同时释放出具有抑菌性能的Cu2+[8]。
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图 6 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在不同浓度下对禾谷镰刀菌病在第 3~5 天的抑菌情况Figure 6. Inhibition of Fusarium graminearum disease by Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations at 3-5 d表 2 禾谷镰刀菌病原菌抗真菌活性测试结果Table 2. Results of antifungal activity test of Fusarium graminearum pathogensDay 3 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.339x– 0.4266 18.19 0.140 0.9696 Az/CaCO3 y=0.394x– 0.3035 5.77 0.138 0.9592 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.475x– 0.1310 1.88 0.136 0.9776 Day 4 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.468x– 0.4708 11.41 0.145 0.9040 Az/CaCO3 y=0.439x– 0.3869 7.87 0.141 0.9608 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.526x– 0.2334 2.79 0.140 0.9042 Day 5 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.447x– 0.6147 18.40 0.150 0.9648 Az/CaCO3 y=0.556x– 0.4176 5.61 0.145 0.9977 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.558x–0.245 2.80 0.140 0.9361 Note: EC50—Median effect concentration. 2.8 小麦发芽率的安全性分析
嘧菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，容易对小麦产生药害，高剂量条件下会明显抑制种子发芽[26-28]。为此，通过小麦种子发芽实验研究了不同制剂对小麦种子发芽率的影响。如图7所示，在不同药物浓度(10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L)下，Az/CaCO3@TA-Cu处理的小麦发芽率均优于Az原药和Az/CaCO3处理的种子，在高浓度(30 mg/L)的条件下，Az/CaCO3@TA-Cu处理的种子发芽率为26%，明显高于Az原药(15%)和Az/CaCO3(23%)处理的种子。由此可见，Az/CaCO3@TA-Cu可有效降低嘧菌酯对小麦发芽率的影响，提高嘧菌酯使用的生物安全性。
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图 7 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在不同浓度下对小麦发芽的影响Figure 7. Effects of Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations on germination of wheat2.9 制备样品对斑马鱼的安全性分析
此外，利用斑马鱼急性毒性试验进一步比较了不同药剂的生物安全性。如图8所示，Az原药、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu微粒的毒性随着时间的增加而增加。在不同药物浓度(0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L)下，Az/CaCO3@TA-Cu对斑马鱼的毒性比Az原药和Az/CaCO3低1.2~4.6倍。结果表明，Az/CaCO3@TA-Cu相对于Az原药和Az/CaCO3，对斑马鱼表现出更优的生物安全性。
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图 8 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu 在不同浓度下对斑马鱼的影响Figure 8. Effects of Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations on zebrafish3. 结 论
(1)在共沉淀-吸附法制备嘧菌酯(Az)/CaCO3的基础上，通过表面包覆单宁酸(TA)-Cu2+络合物制得双pH响应性释放功能的农药载药系统(Az/CaCO3@TA-Cu)。 SEM及EDS元素图谱验证了Az/CaCO3@TA-Cu的结构与组成。电位(ζ)、红外吸收光谱和热重分析进一步验证了嘧菌酯成功负载及单宁酸-Cu2+络合物的成功包覆。
(2)在模拟释放研究中，Az/CaCO3@TA-Cu 表现出pH响应性释放功能，酸性和碱性环境均可促进载药系统中 Az 的释放速度。
(3)抑菌实验表明，Az/CaCO3@TA-Cu对禾谷镰刀菌具有良好的抑菌性能。此外，Az/CaCO3@TA-Cu对小麦发芽和斑马鱼表现出良好的生物安全性。
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图 1 CaCO3 (a)和单宁酸包覆的嘧菌酯/多孔CaCO3载药系统(Az/CaCO3@TA-Cu) (b)的SEM图像及Az/CaCO3@TA-Cu中的O、Ca、Cl和Cu元素映射图(c)
Figure 1. SEM images of CaCO3 (a) and tannic acid-coated pyrimethanil/porous CaCO3 carrier system (Az/CaCO3@TA-Cu) (b), elemental mapping of O, Ca, Cl and Cu in Az/CaCO3@TA-Cu (c)
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图 2 Az、CaCO3、Az/CaCO3、Az/CaCO3@TA-Cu的电位图(a)和红外吸收光谱图(b)
Figure 2. Potentials (a) and FTIR spectras (b) of Az, CaCO3, Az/CaCO3, and Az/CaCO3@TA-Cu
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图 3 Az、Az/CaCO3、Az/CaCO3@TA-Cu的TG曲线(a)和在土壤中的释放曲线(b)
Figure 3. TG curves (a) and release curves in soil (b) of Az, Az/CaCO3, and Az/CaCO3@TA-Cu
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图 4 (a) Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu中Az的释放曲线；(b)不同pH条件下 Az/CaCO3@TA-Cu的释放曲线
Figure 4. (a) Release curves of Az in Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu; (b) Release curves of Az/CaCO3@TA-Cu under different pH conditions
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图 5 使用零级方程(a)、一级方程(b)、Higuchi方程(c)、Ritger-Peppas方程(d)拟合Az/CaCO3@TA-Cu在不同pH条件下的曲线
Figure 5. Fitting of Az/CaCO3@TA-Cu curves at different pH conditions using zero-order equation (a), first-order equation (b), Higuchi equation (c), and Ritger-Peppas equation (d)
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图 6 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在不同浓度下对禾谷镰刀菌病在第 3~5 天的抑菌情况
Figure 6. Inhibition of Fusarium graminearum disease by Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations at 3-5 d
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图 7 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu在不同浓度下对小麦发芽的影响
Figure 7. Effects of Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations on germination of wheat
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图 8 Az、Az/CaCO3和Az/CaCO3@TA-Cu 在不同浓度下对斑马鱼的影响
Figure 8. Effects of Az, Az/CaCO3 and Az/CaCO3@TA-Cu at different concentrations on zebrafish
表 1 通过拟合几个动力学方程计算Az/CaCO3@TA-Cu释放Az的参数
Table 1 Parameters for Az/CaCO3@TA-Cu release of Az by fitting several kinetic equations
Model pH k n R2 Zero-order 5 0.555 − 0.618 7 0.448 − 0.572 9 0.294 − 0.740 First-order 5 0.159 − 0.895 7 0.130 − 0.813 9 0.155 − 0.963 Higuchi 5 6.570 − 0.851 7 3.237 − 0.921 9 5.397 − 0.820 Ritger-Peppas 5 28.416 0.226 0.978 7 11.815 0.259 0.991 9 21.980 0.235 0.951 Notes: k—Release rate constant; n—Release characteristic index; R2—Regression coefficient. 
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表 2 禾谷镰刀菌病原菌抗真菌活性测试结果
Table 2 Results of antifungal activity test of Fusarium graminearum pathogens
Day 3 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.339x– 0.4266 18.19 0.140 0.9696 Az/CaCO3 y=0.394x– 0.3035 5.77 0.138 0.9592 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.475x– 0.1310 1.88 0.136 0.9776 Day 4 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.468x– 0.4708 11.41 0.145 0.9040 Az/CaCO3 y=0.439x– 0.3869 7.87 0.141 0.9608 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.526x– 0.2334 2.79 0.140 0.9042 Day 5 Sample Toxicity regression equation EC50/(mg·L−1) Standard error R2 Pure Az y=0.447x– 0.6147 18.40 0.150 0.9648 Az/CaCO3 y=0.556x– 0.4176 5.61 0.145 0.9977 Az/CaCO3@TA-Cu y=0.558x–0.245 2.80 0.140 0.9361 Note: EC50—Median effect concentration.
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目的
农药在现代农业生产中扮演着至关重要的角色。然而，传统农药制剂在使用过程中存在靶标利用率低，环境污染严重等问题，这不仅导致巨额经济损失，还对人类健康造成了严重危害。因此开发刺激响应性农药控释系统为提高农药利用效率和减少环境污染提供了强有力的策略。本文采用共沉淀-吸附法构建了一个单宁酸和Cu络合物包裹的载药碳酸钙微球，探索其理化性能、释放性能及安全性研究。
方法本研究中，以可溶性淀粉、醋酸钙和碳酸铵为原料，采用共沉淀法制备多孔碳酸钙微球(CaCO)，然后通过浸渍吸附法获得负载嘧菌酯(Az)的多孔碳酸钙微球(Az/CaCO)，并在复合微球表面进一步包覆单宁酸-Cu络合物，构建了一个具有双pH响应性的嘧菌酯控释系统(Az/CaCO@TA-Cu)。
结果我们利用扫描电子显微镜(SEM)、能谱仪(EDS)、傅里叶变换红外(FTIR)、热重分析仪(TGA)、马尔文ZETA电位仪等对Az/CaCO@TA-Cu的形貌和结构进行了详细分析。接下来，我们研究了嘧菌酯在土壤中的释放行为，并考察了不同pH值下的响应性释放性能。此外，我们通过菌丝体生长速率实验和斑马鱼安全试验评估了Az/CaCO@TA-Cu的抑菌性能和生物安全性能。(1)电子显微镜(SEM)和能谱仪(EDS)研究表明单宁酸-Cu络合物对Az/CaCO的成功包裹。傅里叶变换红外(FTIR)、热重分析仪(TGA)、马尔文ZETA电位仪也进一步证明了单宁酸-Cu络合物对Az/CaCO的成功包裹，并测得了其载药量为16.42%。(2)模拟释放研究嘧菌酯在土壤中的释放行为，并考察了不同pH值下的响应性释放性能，结果表明Az/CaCO@TA-Cu具有良好的缓释性能和pH控释性能，在pH=7的磷酸缓冲溶液中96 h累积释放率为36.99%，而在pH＝5和pH＝9条件下的累积释放率分别为74.32%和58.79%。(3)通过菌丝生长速率测定不同样品对禾谷镰刀菌的抑制效果。菌丝体生长速率实验表明Az/CaCO@TA-Cu对禾谷镰刀菌生长具有较好的抑制作用，中值抑制浓度为纯Az和Az/CaCO的6.58倍和3.28倍。(4)嘧菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，容易对小麦产生药害，高剂量条件下会明显抑制种子发芽。为此，我们通过小麦种子发芽实验研究了不同制剂对小麦种子发芽率的影响。小麦发芽率统计结果显示，Az/CaCO@TA-Cu相对于Az/CaCO和纯Az表现出更优的生物安全性。(5)利用斑马鱼急性毒性试验进一步比较了不同药剂的生物安全性。Az/CaCO@TA-Cu对斑马鱼的毒性比Az原药和Az/CaCO低1.2~4.6倍。结果表明，Az/CaCO@TA-Cu相对于Az原药和Az/CaCO，对斑马鱼表现出更优的生物安全性。
结论在共沉淀-吸附法制备Az/CaCO的基础上，通过表面包覆单宁酸-Cu络合物制得双pH响应性释放功能的农药载药系统(Az/CaCO@TA-Cu)。 SEM及EDS元素图谱验证了Az/CaCO@TA-Cu的结构与组成。ζ-电位、红外吸收光谱和热重分析进一步验证了嘧菌酯的成功负载以及单宁酸-Cu络合物的成功包覆。在模拟释放研究中，Az/CaCO@TA-Cu 表现出pH响应性释放功能，酸性和碱性环境均可促进载药系统中 Az 的释放速度。抑菌实验表明Az/CaCO@TA-Cu对禾谷镰刀菌具有良好的抑菌性能。此外，Az/CaCO@TA-Cu对小麦发芽和斑马鱼表现出良好的生物安全性。
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