Preparation and properties of hydroxyapatite nanofibers reinforced gelatin hydrogel modified by methacrylic anhydride composite hydrogel
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摘要: 采用溶剂热法制备了具有超高长径比的羟基磷灰石(HAP)纳米纤维，并将其与甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)结合，利用紫外光交联制备了HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶。通过SEM、XRD、力学测试、溶胀测试、降解测试、细胞培养等对HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶进行结构表征和性能测试。SEM断面观察表明，HAP纳米纤维/GelMA水凝胶呈三维孔隙贯通的多孔结构。力学实验表明，HAP纳米纤维能有效增强水凝胶的弹性模量，且随着HAP纳米纤维添加量的增加，力学性能增强效果越明显。溶胀实验表明，当HAP纳米纤维质量分数为5.2wt%~14.2wt%时，HAP纳米纤维复合水凝胶的溶胀率变化不明显，当质量分数为18.2wt%时，溶胀率降低。降解实验表明，HAP纳米纤维的加入能有效保持水凝胶结构形态，使其更加稳定可控。细胞包裹培养实验表明，HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶能为细胞提供良好的三维生长环境，表现出优良的生物相容性。本实验制备的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在组织工程领域有着良好的应用前景。
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关键词:
- 羟基磷灰石纳米纤维 /
- 甲基丙烯酸酐改性明胶 /
- 复合水凝胶
Abstract: Hydroxyapatite (HAP) nanofibers with ultra-high aspect ratio were prepared by a solvothermal method. HAP nanofibers reinforced composite hydrogel combined with gelatin modified by methacrylic anhydride(GelMA) was prepared by UV crosslinking. The composite hydrogel was characterized by SEM, XRD, mechanical test, swelling test, degradation test and cell culture, etc. The results of the cross-sectional morphology show that the HAP fiber/GelMA composite hydrogel has 3D porous structure with porous structure. Mechanical experiments show that HAP nanofibers can effectively enhance the elastic modulus of the composite hydrogel. With the increase of HAP nanofibers addition, the mechanical performance enhancement effect of the HAP/GelMA composite hydrogel is more obvious. The swelling experiments show that the swelling rate does not change significantly when the mass fraction of HAP fiber is 5.2wt%-14.2wt%, while the swelling rate decreases when the mass fraction is 18.2wt%. The degradation experiments show that the addition of HAP nanofibers can effectively maintain the structure of hydrogel and make it more stable and controllable. The cell co-culture experiments show that the HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel can provide a great 3D growth environment for encapsulated cells, showing excellent biocompatibility. The HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel prepared in the experiment has a good application prospect in the field of tissue engineering. -
通过体外组织工程构建活体器件替代受损的组织和器官是生物医学工程领域的研究热点，而支架材料是组织工程三大要素之一[1]。甲基丙烯酸酐改性明胶(Gelatin modified by methacrylic anhydride, GelMA)是组织工程支架较好的选择，具有可光交联的特性，同时继承明胶的自然优势。特别地，明胶是胶原蛋白水解的主要产物，并保留胶原蛋白的化学和生物特征，包括细胞响应特性、细胞黏附位点和蛋白降解特性。GelMA水凝胶为网络状多孔结构，具有类似于细胞外基质的性质，与细胞生存微环境的结构相似，生物相容性良好，可促进细胞生长和组织再生，且易于加工，适合作为组织工程支架材料[2-3]。采用紫外光引发交联，所制备水凝胶更加稳定，且可将细胞包裹在水凝胶内部，为细胞增值提供三维生长环境，促进成骨，有利于成骨分化。
但是，目前传统水凝胶普遍存在力学性能较差的缺点，已有多种增强方法被用于改性明胶水凝胶。李思迪等[4]和刘东等[5]将磷酸三钙和硅酸钙粉末掺入海藻酸钠水凝胶，改善了其热稳定性、溶胀性能和生物相容性。但是粉末用于水凝胶改性，其耗散能量有限。而纳米纤维在改善水凝胶力学性能方面有独特的优势。纳米细菌纤维素[6]和聚乙二醇改性的纳米纤维素[7]分别被用来增强聚乙烯醇水凝胶的力学性能、溶胀度和抗疲劳性能等。常规纤维虽然为骨再生提供一定的力学强度或稳定性，但其诱导间充质干细胞成骨分化的能力较差，导致其在组织工程领域应用受限[8-10]。用于骨组织工程的水凝胶通常需要引入骨诱导因子[11-12]或者生物活性陶瓷[3, 13-14]，从而提高水凝胶骨再生能力。
天然骨实际上是一种有机-无机复合物，由矿物质(主要是磷酸钙)和有机基质(主要是I型胶原)组成[15]。羟基磷灰石(HAP)是天然无机材料，具有良好的生物学性能，其富含的钙盐成分与生物体骨组织极其相似，具有良好的生物活性和促进干细胞成骨分化的能力，可与人体宿主骨形成良好的化学键性结合[16]，并且在结构上也与人体骨组织中相似，故生物活性HAP纳米纤维与GelMA水凝胶复合，模拟了细胞外基质，将为细胞提供更好的成骨环境。
综上所述，本文欲制备羟基磷灰石纳米纤维增强甲基丙烯酸酐改性明胶复合水凝胶(HAP/GelMA复合水凝胶)，在增强明胶水凝胶力学性能的同时促进包裹细胞成骨分化。
1. 实验材料及方法
1.1 原材料
实验试剂为CaCl2、NaH2PO4、NaOH、油酸、无水乙醇、明胶、磷酸缓冲液(PBS)、甲基丙烯酸酐、光引发剂I2959，均为分析纯，购至Aladdin试剂公司；实验用水均为自制去离子水。
1.2 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的制备
1.2.1 HAP纳米纤维
将10 mL NaOH溶液缓慢滴加于等比例的乙醇与油酸的混合液中，混匀后逐滴滴加10 mL CaCl2溶液和5 mL NaH2PO4·2H2O溶液。将混合物置于180℃进行水热反应9 h后分散在无水乙醇中，使用乙醇和去离子水清洗混合物再冷冻干燥[17]。
1.2.2 GelMA水凝胶的制备
一定量的A型明胶溶解于50 mL PBS溶液中，50℃下磁力搅拌，待溶液澄清透明后，逐滴加入定量的甲基丙烯酸酐，3 h后将溶液稀释，于透析袋截留重均分子量Mw=12 000改性分子，于60℃烘箱中透析6天，透析结束后进行冷冻干燥[18]。
1.2.3 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶
将一定量的GelMA溶于PBS配制的0.5%的光引发剂I2959，并进行避光处理。分别称取0 mg、5 mg、15 mg、20 mg的HAP纳米纤维加入到该溶液中(HAP纳米纤维质量分数分别是0wt%、5.2wt%、14.2wt%、18.2wt%)，混合并超声处理2 min，使其分散均匀。编号及含量如表1所示。
表 1 羟基磷灰石(HAP)纳米纤维/甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)复合水凝胶编号及含量Table 1. Sample of hydroxyapatite(HAP) nanofibers/gelatin modified by methacrylic anhydride(GelMA) composite hydrogelNo. HAP/
mgGelMA/
mgPhotoinitiator/
mgPBS/
mLMass fraction/
wt%0HAP/
GelMA0 90 5 1 0 5HAP/
GelMA5 90 5 1 5.2 15HAP/
GelMA15 90 5 1 14.2 20HAP/
GelMA20 90 5 1 18.2 Note: PBS—Phosphate buffer. 将180 μL的HAP纳米纤维与预聚物混合物注入模具中并采用S1500紫外光源照射30 s(360 nm、7.0 mW/cm2)后取出。整个制备流程如图1所示。
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图 1 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的制备流程Figure 1. Schematic illustration of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel1.3 测试与表征
1.3.1 HAP纳米纤维结构与成分分析
水凝胶冻干后液氮淬断喷金后采用JSM-7800F型场发射扫描电子显微镜(日本电子公司)观察材料断面形貌，采用SmartLab-9智能X射线衍射仪(日本理学)及PerkinElmer Spectrum one spectrometer型傅里叶红外光谱仪(美国铂金埃尔默公司)考察材料组成。
1.3.2 HAP纳米纤维的矿化测试
取20 mg的HAP纳米纤维分散于30 mL模拟体液(SBF)溶液中，密封置于37℃恒温箱中。在1天、3天、5天时分别取适量分散于SBF中的HAP纳米纤维，去离子水清洗后观察其矿化情况。
1.3.3 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的力学性能
通过凝胶的弹性模量和凝胶应力-应变曲线来表征其力学性能。制备出直径为7.92 mm、厚度为3.56 mm的圆柱形凝胶样品，利用CMT1202电子万能试验机(中国珠海SUST电气设备有限公司)对水凝胶材料在轴向方向上用200 N进行压缩测试，压缩速率为1 mm/min，压缩至水凝胶破裂停止压缩，从而获得水凝胶压缩过程中的应力-应变曲线。每组样品取5个样品进行测试，样品应力-应变曲线取应变量前10%计算水凝胶的压缩模量，所得弹性模量表达式为平均值±标准方差。
1.3.4 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的溶胀性能
将HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶冷冻干燥后，记录其干重。然后将其在室温条件下浸泡于pH=7.4的PBS缓冲液中，置于37℃恒温箱中，分别在预定时间点取出复合水凝胶材料，吸掉表面水分并称重。样品大小为每组5个水凝胶。HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在模拟体液条件下溶胀比Rs计算公式为
Rs=(W1−W0)/W0×100% (1) 其中：W0为干燥后质量(g)；W1为吸水后的质量(g)。
1.3.5 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的降解性能
将HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶冷冻干燥并称量干重，将需要降解1天、3天、5天的水凝胶中各自加入6 mL的PBS缓冲液，放置摇床进行降解，设置温度为37℃、转速为120 r/min，待降解时间到达后，取出离心管中的PBS缓冲液，用去离子水清洗两次，进行冷冻干燥，并记录此时的重量。HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在模拟体液条件下降解率Vc计算公式为
Vc=(W0−W)/W0×100% (2) 其中：W0为0天水凝胶干燥后质量(g)；W为降解1天、3天、5天后干燥的质量(g)。
1.3.6 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的细胞黏附及增殖
选用HAP纳米纤维添加量为15 mg(编号为15HAP/GelMA)的HAP/GelMA复合水凝胶进行细胞培养。首先在HAP纳米纤维上接种2×104个MC3T3-E1细胞，在接种1天、3天后，用1 mL荧光染料(碘化丙啶(PI)，二醋酸荧光素(FDA))染色2 min，用PBS洗涤后，用荧光显微镜观察样品。将接种细胞3天后HAP纳米纤维置于模具中，滴加180 μL GelMA光引发剂混合溶液，使用紫外光照射15 s，将接种细胞的HAP纳米纤维包裹在水凝胶内部继续培养，在1天、3天、5天时进行染色4 min后进行清洗并用荧光显微镜观察。
2. 结果与讨论
2.1 HAP纳米纤维形貌及成分
图2为HAP纳米纤维的SEM图像。可明显观察到采用溶剂热法所制备的HAP纳米纤维，其长度太长，在SEM视野下无法准确测量，具有超高的长径比。且呈弯曲状分布即具有良好柔韧性，但纤维呈现粗细不均匀分布，这是因为HAP纳米纤维在反应中产生了自组装，由单条长纤维自组装成了一束，所以会产生不均匀的排布。
图3(a)为HAP纳米纤维XRD图谱。可见，HAP纳米纤维XRD图谱与HAP标准卡片(JCPDS#09-0432)基本重合，证明了所制备的纤维具有较纯的HAP相成分。值得注意的是，2θ=33°时，样品中的特征峰异常尖锐，超过了标准卡片的特征峰，这可能是所制备的HAP纳米纤维沿着C轴择优生长所造成的。
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图 3 HAP纳米纤维的XRD图谱(a)和FTIR图谱(b)Figure 3. XRD patterns (a) and FTIR spectrum (b) of HAP nanofibers图3(b)为HAP纳米纤维FTIR图谱。可见，1 032~1 096 cm−1处的强吸收峰为PO4的P=O键对称伸缩振动峰和反对称伸缩振动谱带，而570~605 cm−1处的吸收谱带为P—O基团的弯曲振动特征吸收谱带，1 639 cm−1、3 457 cm−1处为O—H基团振动特征吸收峰，2 800~3 000 cm−1处推测为油酸分子中的CH2伸缩振动吸收峰，所制备材料吸收峰位置与HAP基本相同，只是相对强度有所不同。由此可以推断产物为HAP。
2.2 HAP纳米纤维矿化结构
图4为HAP纳米纤维矿化结构SEM图像。从图4(a1)、图4(b1)、图4(c1)可以观察到，随着矿化时间的增加，该HAP纳米纤维的表面形貌发生了明显的变化，且变化程度随矿化时间的增加而增加。其中图4(a1)HAP纳米纤维的表面形貌基本无太大变化，从图4(a2)可以看出，HAP纳米纤维表面有薄薄的一层生长物；而图4(b1)的HAP纳米纤维中可明显观察到纤维的端部和部分中间位置都生长出了矿化晶体，从图4(b2)可观察到这种物质的形貌类似于花朵般簇状结构；而从图4(c1)就可以更加明显地看到HAP纳米纤维全部长满了矿化晶体，且分布均匀。我们推测，该HAP纳米纤维能诱导SBF中的PO43−、Ca2+、CO32−在其表面沉积，形成类骨磷灰石。
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图 4 矿化1天((a1)、(a2))、3天((b1)、(b2))和5天((c1)、(c2))的HAP纳米纤维的SEM图像Figure 4. SEM images of HAP nanofibers mineralized for 1 day ((a1),(a2)), 3 days ((b1),(b2)) and 5 days ((c1),(c2))根据之前的报道，在SBF的环境下可以在表面沉积出类似于骨组织成分的无机物，有利于材料与宿主骨之间形成良好的化学键性结合，从而有利于成骨再生[19-20]。由此可以看出，HAP纳米纤维具有良好的生物活性，因为HAP纳米纤维具有较高的长径比，所以考虑将HAP纳米纤维与水凝胶结合，可用于增强水凝胶的成骨相关的生物活性，同时增强水凝胶的力学性能[9]。
2.3 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的结构
图5为HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶纵截面微观形貌SEM图像。可见，所有HAP纳米纤维/GelMA水凝胶都具有松散的网状多孔结构，孔径大小约为25~100 μm，且分布均匀。HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶中的HAP纳米纤维与GelMA基质能够均匀混合，随着HAP纳米纤维质量分数的增大，水凝胶片层中的HAP纳米纤维明显增多，HAP纳米纤维相互缠绕，为增强力学性能的能量耗散提供了基础[21]。
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图 5 0 HAP/GelMA((a1)、(a2))、5 HAP/GelMA((b1)、(b2))、10 HAP/GelMA((c1)、(c2))、15 HAP/GelMA((d1)、(d2))和20 HAP/GelMA((e1)、(e2))HAP/GelMA复合水凝胶的SEM图像Figure 5. SEM images of HAP/GelMA composite hydrogels of 0 HAP/GelMA((a1),(a2)), 5 HAP/GelMA((b1),(b2)), 10 HAP/GelMA((c1),(c2)), 15 HAP/GelMA((d1),(d2)) and 20 HAP/GelMA((e1),(e2))同时，如图5(b1)~5(d2)所示，随着HAP纳米纤维的增多，HAP纳米纤维不仅在HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶片层中存在，同时也存在于水凝胶孔隙中，可为后续的细胞生长提供更多黏附位点，促进成骨。HAP纳米纤维的加入并未改变HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的网状多孔结构，水凝胶的孔隙贯通的多孔结构有利于细胞和血管的长入，同时有利于营养物质和代谢废物的交换[22]。但是太多HAP纳米纤维的加入，如图5(e1)、图5(e2)所示，会导致HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶孔隙率降低，可能会影响营养物质和代谢废物在水凝胶内部的交换。
2.4 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的力学性能
图6为不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶力学压缩对比。从图6(a1)、图6(b1)、图6(c1)压缩前的复合水凝胶可以看出，纯GelMA水凝胶呈透明状，随着HAP纳米纤维的质量分数增大，透明度逐渐降低，颜色越来越趋近于均匀白色。纯GelMA水凝胶压缩后呈现两种状态：保持原样不产生裂纹或被压成粉碎，这可能是施加作用力太大，超过断裂临界点。而添加了HAP纳米纤维的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶压缩后大多出现裂纹，但大多保持了原状，而不被压成粉碎，即藕断丝连；且随着HAP纳米纤维的质量分数增大，HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在压缩后保持原有形态越好。
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图 6 0 HAP/GelMA((a1)、(a2))、5 HAP/GelMA((b1)、(b2))和15 HAP/GelMA((c1)、(c2))HAP/GelMA复合水凝胶压缩对比照片Figure 6. Compression contrast digital photos of HAP/GelMA composite hydrogels of 0 HAP/GelMA((a1),(a2)), 5 HAP/GelMA((b1),(b2)) and 15 HAP/GelMA((c1),(c2))图7 为不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的弹性模量和应力-应变曲线。水凝胶的压缩模量是根据对应于0%~10%应变的应变-应力曲线图7(b)的线性区域计算的。由图7(a)可见，不添加任何纤维的纯GelMA水凝胶的弹性模量仅为(3.18±0.09) kPa，使用HAP纳米纤维作为增强填料，极大地提高了凝胶状水凝胶的力学强度。随着HAP纳米纤维质量分数的增加，弹性模量显著增大；5HAP/GelMA的压缩模量为(4.44±0.24) kPa；15HAP/GelMA的压缩模量为(6.82±0.76) kPa；20HAP/GelMA的压缩模量为(11.99±2.14) kPa，几乎是纯GelMA水凝胶组的4倍，表明HAP纳米纤维对压缩性能的影响显著，且对水凝胶增强效果较好。力学性能的增强是由于HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶中长纳米纤维的缠绕和重叠形成了更大的、连续的和互连的结构，在压缩试验导致的界面分离时，裂纹不仅仅破坏分子链之间的化学键，还须引发粘接材料本身的非弹性形变，从而耗散额外的能量，导致弹性模量和强度的增加[23-24]。
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图 7 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的弹性模量(a)、应力-应变曲线(b)Figure 7. Elastic modulus (a) and strain-stress curves (b) of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogels with different HAP nanofibers mass fractions2.5 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的溶胀性能
图8为不同HAP纳米纤维含量HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的溶胀率。可见，所有水凝胶在最初1~5 h内迅速吸水，水凝胶的溶胀曲线随后逐渐缓慢上升。HAP纳米纤维增强水凝胶，溶胀比随着HAP纳米纤维含量的增加而逐渐减小。纯GelMA水凝胶与纤维添加量较小的复合水凝胶的溶胀率相接近。虽然HAP纳米纤维的引入减小了水凝胶的内部空间，但同时水凝胶的交联度受到较大影响，而交联度与溶胀比密切相关。较大程度的交联度导致较低的溶胀能力[25]。5HAP/GelMA的交联度较纯水凝胶低，但由于添加量较少，故5HAP/GelMA的溶胀较纯水凝胶稍高；但是15HAP/GelMA和20HAP/GelMA的纳米纤维含量明显增加，水凝胶强度变大，更容易导致能量耗散，这种粘接状态及HAP纳米纤维的超高长径比可以使明胶之间相互连接以形成更致密的空间网络结构和更低的孔隙率，这也由SEM测试证实。因此，水分子不容易进入这些水凝胶，导致相对较低的溶胀能力。这种溶胀特性有利于营养物质和代谢废物在水凝胶内部的交换，有利于包裹细胞，促进细胞的存活[26]。但过于致密的网络可能会阻碍细胞的增殖和迁移，因此需要在水凝胶力学强度与溶胀之间找到平衡，我们选择了添加量适中的15HAP/GelMA进行了后续的细胞实验。
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图 8 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的溶胀比(插图为溶胀24 h的数码照片)Figure 8. Swelling rate of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel with different HAP nanofibers mass fractions (Inset: Swelling digital photo of 24 h)2.6 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的降解性能
图9为不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在不同时间的降解率。可见，0HAP/GelMA组质量损失百分比最高，在第5天时到达100%，即完全降解。随着添加HAP纳米纤维含量的增加，降解率明显降低。其中，5HAP/GelMA在第3天能保持完整形态，在5天时也已大部分降解，由于添加量小，纤维分散不均匀，导致纤维之间网状结构形成不充分，少量的HAP纳米纤维只能使小部分水凝胶保持完整形态。而15HAP/GelMA和20HAP/GelMA均保持较小的降解率(分别为50%和35%左右)，因为纤维的增多，较多长纤维在水凝胶内部相互连接形成更致密的网络状结构，所以水凝胶内部粘接更紧密，能量耗散更多[27-28]。本实验结果表明，HAP纳米纤维在一定程度上保护了水凝胶结构的连续性，从而增加了水凝胶的稳定性和完整性。
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图 9 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在1天、3天和5天的降解率(插图为降解5天的数码照片)Figure 9. Degradation rates of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogels with different HAP nanofibers mass fractions at 1 day, 3 days and 5 days (Inset: digital photo of 5 days)2.7 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的细胞黏附和增殖
图10(a)、图10(b)为细胞直接培养到纤维材料表面1天和3天的荧光显微图像。可以发现，HAP纳米纤维表面染色细胞分布明显，且随着时间从1天增加到3天，活细胞分布更密集，即细胞在HAP纳米纤维表面增殖情况良好，表明HAP纳米纤维对细胞不产生毒害作用。图10(c)~10(e)为进一步将培养细胞后的HAP纳米纤维掺入明胶水凝胶继续培养1天、3天和5天的荧光图像。可见，染色细胞分布明显，而死细胞几乎没有。随着培养时间延长至3天和5天后，可以看到所有基质上的染色细胞数量明显增加，密集分布，而死细胞数量几乎均为零。这表明，HAP纳米纤维及HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶都能很好地支持细胞在其表面的黏附，并且没有引起明显的毒性反应，即复合水凝胶具有良好的生物相容性，并且可以促进细胞的黏附及生长。
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图 10 不同时间HAP纳米纤维与细胞共培养((a)、(b))和复合水凝胶包裹细胞((c)、(d)、(e))的荧光显微图像Figure 10. Fluorescence microscopic images of cells co-cultured with HAP nanofibers((a),(b)) and HAP/GelMA composite hydrogel encapsulated cells((c),(d),(e)) for different times3. 结 论
(1)采用溶剂热法制备超高长径比的羟基磷灰石(HAP)纳米纤维，将其作为增强相加入至甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)水凝胶制备HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶，所制备的HAP纳米纤维能有效增强水凝胶的弹性模量，且随着纤维添加量的增加，力学性能增强效果越明显。
(2) HAP纳米纤维的加入使HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶呈现更加稳定的状态，溶胀效果不受明显影响，在相同降解条件下降解更加缓慢。
(3) HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶能为细胞提供三维生长环境，使细胞黏附生长并增殖，对细胞无毒害作用，具有良好的生物相容性。本实验制备的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在组织工程领域有着良好的应用前景。
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图 1 HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的制备流程
Figure 1. Schematic illustration of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel
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图 3 HAP纳米纤维的XRD图谱(a)和FTIR图谱(b)
Figure 3. XRD patterns (a) and FTIR spectrum (b) of HAP nanofibers
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图 4 矿化1天((a1)、(a2))、3天((b1)、(b2))和5天((c1)、(c2))的HAP纳米纤维的SEM图像
Figure 4. SEM images of HAP nanofibers mineralized for 1 day ((a1),(a2)), 3 days ((b1),(b2)) and 5 days ((c1),(c2))
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图 5 0 HAP/GelMA((a1)、(a2))、5 HAP/GelMA((b1)、(b2))、10 HAP/GelMA((c1)、(c2))、15 HAP/GelMA((d1)、(d2))和20 HAP/GelMA((e1)、(e2))HAP/GelMA复合水凝胶的SEM图像
Figure 5. SEM images of HAP/GelMA composite hydrogels of 0 HAP/GelMA((a1),(a2)), 5 HAP/GelMA((b1),(b2)), 10 HAP/GelMA((c1),(c2)), 15 HAP/GelMA((d1),(d2)) and 20 HAP/GelMA((e1),(e2))
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图 6 0 HAP/GelMA((a1)、(a2))、5 HAP/GelMA((b1)、(b2))和15 HAP/GelMA((c1)、(c2))HAP/GelMA复合水凝胶压缩对比照片
Figure 6. Compression contrast digital photos of HAP/GelMA composite hydrogels of 0 HAP/GelMA((a1),(a2)), 5 HAP/GelMA((b1),(b2)) and 15 HAP/GelMA((c1),(c2))
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图 7 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的弹性模量(a)、应力-应变曲线(b)
Figure 7. Elastic modulus (a) and strain-stress curves (b) of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogels with different HAP nanofibers mass fractions
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图 8 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶的溶胀比(插图为溶胀24 h的数码照片)
Figure 8. Swelling rate of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogel with different HAP nanofibers mass fractions (Inset: Swelling digital photo of 24 h)
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图 9 不同HAP纳米纤维质量分数的HAP纳米纤维/GelMA复合水凝胶在1天、3天和5天的降解率(插图为降解5天的数码照片)
Figure 9. Degradation rates of HAP nanofibers/GelMA composite hydrogels with different HAP nanofibers mass fractions at 1 day, 3 days and 5 days (Inset: digital photo of 5 days)
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图 10 不同时间HAP纳米纤维与细胞共培养((a)、(b))和复合水凝胶包裹细胞((c)、(d)、(e))的荧光显微图像
Figure 10. Fluorescence microscopic images of cells co-cultured with HAP nanofibers((a),(b)) and HAP/GelMA composite hydrogel encapsulated cells((c),(d),(e)) for different times
表 1 羟基磷灰石(HAP)纳米纤维/甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)复合水凝胶编号及含量
Table 1 Sample of hydroxyapatite(HAP) nanofibers/gelatin modified by methacrylic anhydride(GelMA) composite hydrogel
No. HAP/
mgGelMA/
mgPhotoinitiator/
mgPBS/
mLMass fraction/
wt%0HAP/
GelMA0 90 5 1 0 5HAP/
GelMA5 90 5 1 5.2 15HAP/
GelMA15 90 5 1 14.2 20HAP/
GelMA20 90 5 1 18.2 Note: PBS—Phosphate buffer. 
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